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科学对待牛奶中的β-内酰胺酶

文章出处:未知网责任编辑:作者:admin人气:发表时间:2017-11-15 13:13
1、β-内酰胺酶的概念
能裂解青毒素和头孢菌素类抗生素的β-内酰胺环,使它们灭活的水解酶,称为β-内酰胺酶(β-Lactamase),俗称抗生素分解剂,又名解抗剂或金玉兰酶制剂,以青霉素为底物的称为青霉素酶,以头孢菌素作为底物的称头孢菌素酶。
根据β-内酰胺酶的基质特异性,可大致分为青霉素酶、头孢菌毒酶、肟型头孢菌素酶三类。
青霉素酶易于分解青霉素类抗生素,头孢菌素酶对分解头孢菌素类抗生素的活性较高,肟型头胞菌素酶则对青霉素和头孢菌素类都有分解作用,特别更易予分解肟型头孢菌素。产生青霉素酶的遗传因子,主要基点在胞质体DNA上,而产生头孢菌素酶和肟型头孢菌素的遗传因子,则大都在宿主染色体上。青霉素酶从其基特异性或酶的生化性状上的特点,又可分为5种类型(即青霉素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型)。头孢菌素酶和肟型头孢菌素酶属于菌株特有的酶,上述这些酶的精制品用兔做免疫试验均可得到抗体。
然而各种类型的β-内酰胺酶在各自特有的免疫学方面却无相互交叉的现象。
2、牛奶中β-内酰胺酶的来源
 
牛奶中的抗生素分解剂的可能来源,一是外源性,人为加进牛奶中的。二是内源性,牛奶中有关细菌产生的。
外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的物质,违法使用的目的是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。但是内源性β-内酰胺酶的产生也是科学研究基本确认的事实。
在奶畜养殖过程中,为了防治乳房炎、子宫内膜炎等常见疾病,需要用到抗生素和抗菌药物。国际上普遍针对奶畜养殖中使用抗生素和抗菌药物制定最高残留限量,并要求生鲜乳收购环节采用指定的快速方法检测抗生素,不得超过最高残留限量。经检测,未超过最高残留限量的,即是安全、合格的产品。
β-内酰胺类抗生素是在牛奶生产中应用最广泛的抗生素,用于治疗牛乳房炎和其他细菌感染性疾病。由于抗生素的存在,一方面难以成为安全合格的产品,另一方面,还会影响酸奶、奶酪等奶制品的加工生产。为了适应这种需要,市场上开始出现“抗生素分解剂”,也就是β-内酰胺酶。
Korycka-Dahl M等(1985)利用β-内酰胺酶降解牛奶中残留的抗生素,可降低至常规检测方法无法检测的水平。一段时间以来,不法分子将β-内酰胺酶用作牛奶中抗生素的分解剂,以掩盖其抗生素残留超标的事实,从而使超标奶变成合格奶。崔生辉等(2007)人曾在北京零售超市中采集了五个厂家生产的、不同种类的牛奶样品38 个,检测发现,63.2%的样品检出β-内酰胺酶。这一数据反映了“解抗剂”的滥用情况和我国牛奶制品存在着严重的安全隐患。
β-内酞胺酶是绝大多数致病菌产生青霉素类和头抱菌素类耐药性的主要原因。细菌因产生β内酰胺酶而耐药的原因,不单是因为该细菌能水解进入细菌内的β内酰胺类药物,使其基本结构———β内酰胺环被破坏而灭活,而且其产生的β内酰胺酶能在细菌外与抗菌药物呈不可逆性结合而构成屏障,影响其它抗菌药物进入细菌。
人医临床中关于产β-内酞胺酶菌的报道较多,而兽医临床中关于产β-内酞胺酶菌的报道较少,还没有引起兽医临床的足够重视。
张春辉等(2005)报道,分离于河南省荥阳、周口、漯河等不同地区的大肠杆菌、沙门氏菌等30株产β-内酰胺酶阳性率达100%,这对临床择药具有重要意义。胡功政等(2005)报道, 43 株分离菌有33株可产生ß-内酰胺酶,3 株鸡志贺氏菌为ESBLs阳性菌株。其中,鸡大肠杆菌13/14 株、猪大肠杆菌5/7 株、鸡沙门氏菌9/9 株、猪沙门氏菌3/6 株、猪金葡萄球菌0/3 株、鸡志贺氏菌3/3 株、鸡巴氏杆菌0/1 株呈ß-内酰胺酶阳性,总阳性率达76.7%。表明猪禽常见致病菌中,ß-内酰胺酶产生菌的比率相当普遍。
那么奶牛常见致病菌中,ß-内酰胺酶的产生情况又如何呢?奶牛常见致病菌对牛奶品质及内源性ß-内酰胺酶的含量又有何影响呢?这是当前我们迫切需要研究和解决的问题之一。
开展奶牛常见致病菌产ß-内酰胺酶情况和牛奶中内源性ß-内酰胺酶含量的调查,对阐明细菌的耐药机制、耐药与产酶的关系、耐药菌的检测与监控、指导临床合理用药、界定内外源性ß-内酰胺酶含量具有重要意义。
3、牛奶β-内酰胺酶的检测方法与评价
 
目前可行方法有微生物培养法、碘量法和酸量法三种。
①微生物培养法 用利用克拉维酸、舒巴坦的特异性抑制β-内酰胺酶的特点做细菌培养,通过测量抑菌圈得出结果。本法不需特殊试剂, 容易操作, 结果容易判断, 对具良好抗菌活性的抗生素灵敏度好, 但特异性差, 不能用于酶动力学分析。该方法可以检测出牛奶中未反应完全(未失活)的β-内酰胺酶,可用于检测未经过任何加工的牛奶,检出限较低。
②碘量法 本法是根据青霉素或头抱菌素经β-内酰胺酶作用而产生的裂解酸与碘结合, 与淀粉竞争游离碘,从而使兰色的碘淀粉复合物褪色的原理而设计的。本法试剂易得、简便易行、再现性好, 可迅速获取结果, 检测革兰阳性细菌胞外酶阳性率高, 为实验室普遍使用。本法的影响因素多, 有假阳性和假阴性现象, 需作酶阳性和阴性对照。主要不足是需高浓度底物, 灵敏度较差, 不能用于酶动力学分析, 微量碘法可用于酶动力学研究, 改进后可采用自动记录技术测多份样本但不适用于头抱菌素。该方法可检出牛奶中已反应及未反应的β-内酰胺酶,可用于检测鲜奶及奶制品中的β-内酰胺酶,检出限较高。
③酸量法 本法是根据青霉素或头抱菌素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸引起pH值变化,使指示剂色变或碳酸钠溶液释放出二氧化碳的压力变化及以碱滴定来设计的。以利用指示剂色变原理的方法为最多, 有酚红法、甲酚红法、澳甲酚紫法、澳察香草酚蓝法等, 酸量纸条法测定流感嗜血杆菌β-内酰胺酶最为有效, 定性方法以酸量琼脂平板法最为理想, 定量方法以酸量指示剂法如酚红最常用, 但不适用于头抱菌素。压力法等费时冗长、操作较繁, 影响因素多, 又需特殊设备, 很少用。酸量法简单易行, 重复性好, 最易获取结果, 且较灵敏, 结果稳定性好, 假阳性和假阴性结果较少, 适用于大多数实验室, 但不能用于酶动力学分析。
马洁等(2009)据此利用酸度计检测牛奶中β-内酰胺酶的残留量。该方法在磷酸缓冲溶液(PBS) 和牛奶中,对β-内酰胺酶的检出限分别为10U/mL和15U/mL。北京博纳艾杰尔科技有限公司推出一款试剂盒,由中国药品生物制品检定所(NICPBP)研制(崔生辉等,2007),试剂盒内所采用试药、菌株和培养基均是通过NICPBP验证的国家级标准品,可溯源。完全符合中华人民共和国卫生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法》。该试剂盒是检测牛乳中添加β-内酰胺酶的专用试剂盒,检测限为4 U/mL。
这些方法一方面检测限不能达到实际检测的要求,另一方面,均无法区分别内源性和外源性的β-内酰胺酶,无法保护合法的牛奶生产者。如郑颖等报道,在4℃,8~12 h,0.22 U/L的TEM-116型超广谱β-内酰胺酶就能清除牛奶中的青霉素G。目前检测方法的检测限均未能达到此浓度。
4、禁止在牛奶中添加外源性β-内酰胺酶
 
在牛奶中添加外源性的抗生素分解剂已是一个较严重的现象,其现状不容乐观,不仅危害到人类的身体健康,而且对奶牛业的正常发展也造成一定的负面影响。
β-内酰胺酶(金玉兰酶制剂)可能添加到乳与乳制品中,起到掩蔽抗生素的作用,但是由于该制剂的安全性风险未知,因此所有乳制品生产企业严禁在产品中添加此类物质。部分国内的牛奶生产者为了达到“无抗”标准,在牛奶中人为添加该分解剂,给我国奶制品市场造成了混乱。另一方面,该分解剂的滥用也助长了牛奶生产中β-内酰胺类抗生素的滥用,加速了耐药菌的传播,严重威胁了中国奶业的可持续发展。
2008年11月28日,卫生 部、工业和信息化部、公 安 部、监 察 部、农 业 部、商 务 部、工 商 总 局、质 检 总 局和食品药品监管局联合发布“关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知”(卫监督发〔2008〕60号),通知指出:“当前在食品中违法添加非食用物质和滥用食品添加剂问题十分严重,对人民群众身体健康和生命安全造成极大威胁,严重损害了我国食品产品的声誉。” 2009年2月4日,在专项整治专家委员会提出的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》中,β-内酰胺酶(金玉兰酶制剂、抗生素分解剂)位列其中。2009年3月6日,卫生部发布“关于印发《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》的通知(卫监督发〔2009〕21号)”,通知指出在乳及乳制品生产中添加β-内酰胺酶(解抗剂)的违法行为是专项整治近期工作的重点。
5、科学对待内源性β-内酰胺酶
针对“细菌性疾病-抗生素防治-抗生素超标-β-内酰胺酶超标”的问题,应正确科学对待。
 
①开展原料奶和隐性乳房炎致病菌内源性β-内酰胺酶的研究 临床抗生素防治失败的原因,往往是细菌对药物产生了耐药性。在诸多耐药机理中,细菌产生β-内酰胺酶以分解相关抗生素是一种重要的机制。因此,在防治奶牛乳房炎等常见疾病时,要注意判断其是否为产酶菌,以采用有效的抗生素或抗菌剂进行治疗,是提高防治效果的关键。
②建立内外源性β-内酰胺酶鉴别诊断技术 通过阐明原料奶中内源性β-内酰胺酶含量与隐性乳房炎有关指标的相关性,为区别内外源性β-内酰胺酶的研究提供依据,研究制订可区别内外源性β-内酰胺酶相对含量的技术标准。内源性β-内酰胺酶的存在是科学研究基本确认的事实。上海某奶牛场没使用过含解抗剂之类的药物,但在2009年6月14日、17日的牛奶中检测到含有解抗剂,随后随机采了五头打针的牛和五头没打针的牛,结果含有解抗剂各一半,这一事实说明了内源性β-内酰胺酶的存在,但也给β-内酰胺酶的监管提出了新的难题。因此,开展内外源性β-内酰胺酶鉴别诊断技术的研究,对于切实打击不法添加者,同时保护合法生产者具有重要的意义。
③开发新一代高效安全的抗菌剂如抗菌肽以代替抗生素在奶牛细菌性疾病防治中的应用 只有从源头解决应用抗生素导致的药物残留及解抗剂的使用问题解决,才能使我们所生产的牛奶成为一流的安全产品。抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌作用的阳离子小肽,是生物体先天性免疫的重要组成成分。抗菌肽不但广谱抗菌,能抑杀耐药性菌株,而且它的杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变,从而成为最具开发前景的抗生素替代品。
 
  如您还有其他疑问或需要解决其他问题,不妨联系我们的在线客服:01053635882,我们将竭诚为您提供帮助。
 
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